Zellbiologisches Praktikum - Cheatsheet

Sterilarbeit und Kontaminationsvermeidungstechniken

Definition:

Techniken zur Vermeidung von biologischer Kontamination während der Zellkulturarbeit.

Details:

• Arbeitsbereich mit 70% Ethanol desinfizieren
• Hände waschen und desinfizieren
• Laminar-Flow-Werkbank korrekt nutzen (Sicherstellen, dass der Luftstrom nicht blockiert wird)
• Arbeitsmaterialien sterilisieren (z.B. durch Autoklavieren oder UV-Behandlung)
• Nur sterile Gefäße und Pipetten verwenden
• Arbeitskleidung tragen (Kittel, Handschuhe, ggf. Mundschutz)
• Werkbank regelmäßig reinigen und desinfizieren
• Arbeitsabläufe planen, um unnötige Bewegungen zu vermeiden
• Verpackungen und Pipettenspitzen nur am Rand anfassen

Passagierung von Zelllinien

Definition:

Übertragung von Zellen aus einer Kultur in eine neue Kultur, um das Wachstum und die Vitalität der Zelllinie aufrechtzuerhalten.

Details:

• Subkultivierungsprotokoll bestimmt: Typ der Zelle, Konfluenz
• Erforderliche Schritte: Medium entfernen, Zellen abspülen (\textit{PBS})
• Trypsinisierung: Zugabe von Trypsin-EDTA zur Zellablösung
• Inkubation bei 37°C, 5 Minuten
• Trypsin-Inaktivierung: Zugabe von Medium
• Resuspendierung: Pipettieren zur Homogenisierung
• Zählung: Zellzahlbestimmung (\textit{Zählkammer, Zellzähler})
• Suspension in frischem Kulturmedium: Passagierungsverhältnis (\textit{z.B. 1:3, 1:6})
• Plattieren: Verteilung der Zellen auf neue Kulturgefäße
• Inkubation bei 37°C, 5% CO₂

Fluoreszenzmikroskopie

Definition:

Mikroskopietechnik zur Beobachtung von Strukturen mithilfe von Fluoreszenzfarbstoffen. Nutz photoneninduzierte Fluoreszenz zum Detektieren spezifischer Moleküle.

Details:

• Fluorophore: Absorption von Licht einer Wellenlänge, Emission längerer Wellenlänge
• Anregungs- und Emissionsspektren beachten
• Weitfeld-, Konfokal- und Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie
• FRET und FRAP als spezielle Anwendungen
• Hochauflösende Methoden: STED, PALM, STORM
• Probenvorbereitung: Fixierung, Markierung, Einbettung
• Wichtige Parameter: Lichtquelle, Filter, Detektor

Live-Cell Imaging Techniken

Definition:

Techniken zur Echtzeit-Beobachtung lebender Zellen unter dem Mikroskop.

Details:

• Verwendung: Analyse zellulärer Prozesse in Echtzeit
• Methoden: Fluoreszenzmikroskopie, Konfokalmikroskopie, Zwei-Photonen-Mikroskopie, TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence)
• Parameter: Zellmigration, Zellteilung, Signaltransduktion
• Erforderliche Ausrüstung: Mikroskop, Fluoreszenzfarbstoffe, spezifische Zellkulturen
• Probleme: Phototoxizität, Photobleaching, hohe Datenmengen
• Beispiele: GFP (Green Fluorescent Protein) zur Proteinmarkierung

PCR und Restriktionsenzymanalyse

Definition:

PCR (Polymerase-Kettenreaktion) dient zur Vervielfältigung spezifischer DNA-Sequenzen. Restriktionsenzymanalyse schneidet DNA an spezifischen Sequenzen und ermöglicht die Analyse der Schnittmuster.

Details:

• PCR-Zyklen: Denaturierung (ca. 94°C), Annealing (50-65°C), Elongation (72°C)
• Erforderliche Komponenten: Template-DNA, Primer, dNTPs, Puffer, Taq-Polymerase
• Restriktionsenzyme erkennen palindromische DNA-Sequenzen
• Typische Enzyme: EcoRI, BamHI, HindIII
• Resultierende Fragmente können durch Gelelektrophorese analysiert werden
• Verwendung zur Genotypisierung, Klonierung, Mutationsanalyse

Ligation und Transformation

Definition:

Prozess zur Verknüpfung von DNA-Fragmenten und deren Einführung in Bakterienzellen.

Details:

• Ligation: Verknüpfung von DNA-Fragmenten durch DNA-Ligase.
• Transformation: Einbringen der ligierten DNA in kompetente Bakterienzellen.
• Mit DNA-Plasmiden arbeiten, die ein Antibiotikaresistenzgen beinhalten.
• Selektionsmedium mit passendem Antibiotikum verwenden.
• Wärmeschock oder elektroporation zur Transformation einsetzen.

Induzierbare Expressionssysteme

Definition:

Systeme zur kontrollierten Genexpression durch externe Stimuli wie Temperatur, Chemikalien oder Licht.

Details:

• Verwendung: Steigerung oder Reduktion der Zielgenexpression zu gewünschten Zeitpunkten.
• Bestandteile: Promotor, Operator, Repressor/Aktivator, Induktor.
• Beispiele:
• Tet-On/Tet-Off System (Tetracyclin-induziert)
• GAL4/UAS System (Galactose-induziert)
• lac Operon System (IPTG-induziert)
• Vorteile: Zeitliche und räumliche Kontrolle der Genexpression, reduzierte Nebenwirkungen.
• Nachteile: Potenzielle Toxizität der Induktoren, Lecktranskription (baseline expression).

Analyse von Proteinen mittels SDS-PAGE und Western Blot

Definition:

Techniken zur Trennung und Analyse von Proteinen aufgrund ihrer Größe (SDS-PAGE) und anschließendem Nachweis mittels spezifischer Antikörper (Western Blot).

Details:

• SDS-PAGE: Sodium Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese - Proteine denaturieren und gleichmäßig negativ laden.
• Elektrophorese: Trennung der Proteine nach Größe durch Gel aufgrund der angelegten Spannung.
• Western Blot: Transfer der Proteine auf eine Membran ('Blotting').
• Nachweis: Membran blockieren und mit spezifischen Primärantikörpern inkubieren.
• Sekundärantikörper: Bindet an Primärantikörper, oft mit Enzym (z.B. HRP) zur Detektion gekoppelt.
• Signaldetektion: Chemilumineszenz oder Farbreaktion zum Sichtbarmachen der Proteinbänder.