Zellbiologisches Praktikum - Exam

Aufgabe 1)

Sterilarbeit und KontaminationsvermeidungstechnikenIn einem Zellkultur-Labor ist die Vermeidung von biologischer Kontamination von entscheidender Bedeutung, um zuverlässige experimentelle Ergebnisse zu gewährleisten. Ein sorgfältig durchgeführtes steriles Arbeiten ist daher unumgänglich. Techniken, um eine Kontamination zu vermeiden, beinhalten unter anderem:

• Arbeitsbereich mit 70% Ethanol desinfizieren
• Hände waschen und desinfizieren
• Laminar-Flow-Werkbank korrekt nutzen (Sicherstellen, dass der Luftstrom nicht blockiert wird)
• Arbeitsmaterialien sterilisieren (z.B. durch Autoklavieren oder UV-Behandlung)
• Nur sterile Gefäße und Pipetten verwenden
• Arbeitskleidung tragen (Kittel, Handschuhe, ggf. Mundschutz)
• Werkbank regelmäßig reinigen und desinfizieren
• Arbeitsabläufe planen, um unnötige Bewegungen zu vermeiden
• Verpackungen und Pipettenspitzen nur am Rand anfassen

a)

Beschreibe die Schritte, die Du unternehmen musst, bevor Du mit der Arbeit in einer Laminar-Flow-Werkbank beginnst. Gehe dabei auf jede der oben genannten Techniken ein und erkläre deren Bedeutung für die Vermeidung von Kontamination.

Lösung:

Schritte, die Du unternehmen musst, bevor Du mit der Arbeit in einer Laminar-Flow-Werkbank beginnst:

• Arbeitsbereich mit 70% Ethanol desinfizieren:Bevor Du mit der Arbeit beginnst, reinige und desinfiziere den Arbeitsbereich gründlich mit einer 70%igen Ethanol-Lösung. Diese Lösung tötet Bakterien, Viren und Pilze effektiv ab und reduziert somit die Gefahr einer Kontamination.
• Hände waschen und desinfizieren:Wasche Deine Hände gründlich mit Seife und Wasser, und desinfiziere sie anschließend mit einem alkoholbasierten Handdesinfektionsmittel. Saubere Hände sind essenziell, um die Übertragung von Mikroorganismen auf Deine Arbeitsmaterialien zu verhindern.
• Laminar-Flow-Werkbank korrekt nutzen:Stelle sicher, dass der Luftstrom in der Laminar-Flow-Werkbank nicht blockiert wird, da dieser sterilisierte Luft über den Arbeitsbereich leitet. Positioniere Deine Materialien so, dass der Luftfluss nicht behindert wird und arbeite in einem Bereich, der direkt von der sterilen Luftströmung abgedeckt wird.
• Arbeitsmaterialien sterilisieren:Vergewissere Dich, dass alle Arbeitsmaterialien, die Du verwendest (z.B. durch Autoklavieren oder UV-Behandlung), sterilisiert sind. Dies verhindert, dass Mikroorganismen aus Deinen Arbeitsmaterialien in Deine Zellkulturen gelangen.
• Nur sterile Gefäße und Pipetten verwenden:Stelle sicher, dass alle Gefäße und Pipetten, die Du verwendest, steril sind. Kontaminierte Gefäße oder Pipetten können Deine Zellkulturen mit unerwünschten Mikroorganismen infizieren.
• Arbeitskleidung tragen:Ziehe geeignete Arbeitskleidung an, einschließlich Kittel, Handschuhe und ggf. Mundschutz. Diese Kleidung schützt Deine Zellkulturen vor Kontamination durch Deine Kleidung oder Haut.
• Werkbank regelmäßig reinigen und desinfizieren:Reinige und desinfiziere die Werkbank regelmäßig, um sicherzustellen, dass keine Mikroorganismen im Arbeitsbereich verbleiben, die Deine Experimente beeinträchtigen könnten.
• Arbeitsabläufe planen:Plane Deine Arbeitsabläufe so, dass Du unnötige Bewegungen vermeidest. Jede Bewegung kann potenziell Mikroorganismen in den sterilen Bereich bringen.
• Verpackungen und Pipettenspitzen nur am Rand anfassen:Fasse Verpackungen und Pipettenspitzen nur am Rand an, um Kontaminationen zu vermeiden. Der innere Bereich sollte steril bleiben.

b)

Ein Kollege von Dir hat bei der Zellauszählung festgestellt, dass eine Kontamination der Zellkultur vorliegt, weil in der Kulturflasche Pilzsporen entdeckt wurden. Beschreibe detailliert die potenziellen Fehlerquellen, die diese Kontamination verursacht haben könnten. Beziehe Dich dabei auf die in den Notizen genannten Techniken zur Vermeidung von Kontamination.

Lösung:

Potenzielle Fehlerquellen, die zur Kontamination der Zellkultur mit Pilzsporen geführt haben könnten:

• Arbeitsbereich nicht ausreichend mit 70% Ethanol desinfiziert:Wenn der Arbeitsbereich vor Beginn der Arbeiten nicht gründlich genug mit 70% Ethanol desinfiziert wurde, könnten Pilzsporen auf der Arbeitsfläche verblieben sein und sich in die Kulturflasche übertragen haben.
• Hände nicht gründlich gewaschen und desinfiziert:Unzureichende Handhygiene könnte zur Übertragung von Pilzsporen auf die Arbeitsmaterialien oder direkt auf die Zellkultur geführt haben.
• Laminar-Flow-Werkbank nicht korrekt genutzt:Wenn der Luftstrom in der Laminar-Flow-Werkbank blockiert war oder Materialien falsch platziert wurden, könnte dies dazu geführt haben, dass kontaminierte Luft in den Arbeitsbereich strömt. Dies könnte zur Ansiedlung von Pilzsporen in der Zellkultur geführt haben.
• Arbeitsmaterialien nicht sterilisiert:Wenn Arbeitsmaterialien, wie Pipetten oder Werkzeuge, nicht ordnungsgemäß sterilisiert wurden (z.B. durch Autoklavieren oder UV-Behandlung), könnten Pilzsporen auf diesen Materialien vorhanden gewesen sein und die Zellkultur kontaminiert haben.
• Nicht sterile Gefäße und Pipetten verwendet:Die Verwendung nicht steriler Gefäße oder Pipetten könnte eine direkte Quelle der Kontamination darstellen, da diese Gegenstände Pilzsporen enthalten könnten.
• Keine/unsachgemäße Arbeitskleidung getragen:Wenn keine oder unsachgemäße Arbeitskleidung, wie Kittel, Handschuhe oder Mundschutz, getragen wurde, könnten Pilzsporen von Deiner Kleidung bzw. Deinem Körper auf die Zellkultur übertragen worden sein.
• Werkbank nicht regelmäßig gereinigt und desinfiziert:Eine unregelmäßige oder unzureichende Reinigung und Desinfektion der Werkbank könnte dazu führen, dass sich Pilzsporen ansammeln und schließlich in die Zellkultur geraten.
• Ungeplante Arbeitsabläufe:Unnötige Bewegungen und unsachgemäße Handhabung im Arbeitsbereich könnten zum Transport von Pilzsporen führen. Durch unstrukturierte Arbeitsabläufe könnte außerdem der sterile Bereich kontaminiert worden sein.
• Verpackungen und Pipettenspitzen nicht korrekt gehandhabt:Das unsachgemäße Anfassen von Verpackungen und Pipettenspitzen kann ebenfalls eine Quelle der Kontamination sein. Wenn diese Gegenstände nicht nur am Rand angefasst wurden, könnten Pilzsporen auf die Gefäße und letztlich in die Zellkultur übertragen worden sein.

c)

Die Berechnung der Sterilisationszeit in einem Autoklaven ist wichtig, um sicherzustellen, dass alle Materialien vollständig sterilisert sind. Angenommen, die Sterilisationsformel ist gegeben durch: \[ D = \frac{t}{\theta} \] wobei \( D \) die Dezimalreduktionszeit in Minuten, \( t \) die gesamte Sterilisationszeit in Minuten und \( \theta \) der Zeitfaktor ist. Berechne die Dezimalreduktionszeit, wenn die gesamte Sterilisationszeit 30 Minuten beträgt und der Zeitfaktor 3 Minuten ist. Erkläre die Bedeutung dieses Ergebnisses im Kontext der Sterilisation.

Lösung:

Berechnung der Dezimalreduktionszeit:

Die Dezimalreduktionszeit lässt sich mit der gegebenen Formel berechnen:

\[ D = \frac{t}{\theta} \]

wobei:

• \( t = 30 \) Minuten (gesamte Sterilisationszeit)
• \( \theta = 3 \) Minuten (Zeitfaktor)

Setzen wir diese Werte in die Formel ein, erhalten wir:

\[ D = \frac{30}{3} = 10 \] Minuten

• Die Dezimalreduktionszeit (\( D \)) ist die Zeit, die erforderlich ist, um die Anzahl der Mikroorganismen in der Population um eine Zehnerpotenz (90%) zu reduzieren.
• In diesem Fall beträgt die Dezimalreduktionszeit 10 Minuten. Das bedeutet, dass es 10 Minuten dauert, um 90% der Mikroorganismen während der Sterilisation im Autoklaven zu eliminieren.
• Für die Praxis bedeutet dies, dass bei einer gesamten Sterilisationszeit von 30 Minuten mehrere Dezimalreduzierungen stattfinden. Mehrere Dezimalreduzierungen sorgen dafür, dass die Anzahl der überlebenden Mikroorganismen erheblich verringert wird, was zur vollständigen Sterilisation der Materialien führt.

Bei der Arbeit im Zellkultur-Labor ist ein gründliches Sterilisationsverfahren entscheidend, um sicherzustellen, dass keine lebenden Mikroorganismen die Zellkulturen kontaminieren und die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der experimentellen Ergebnisse beeinträchtigen.

Aufgabe 2)

Du hast eine Zellkultur, die sich im Laufe der Zeit dem maximalen Konfluenzgrad nähert. Um die Zellen weiterhin gesund und wachstumsfähig zu halten, entscheidest Du Dich für die Passagierung nach dem angegebenen Subkultivierungsprotokoll.

a)

Beschreibe detailliert den Schritt des Trypsinisierens in diesem Protokoll. Welche Rolle spielt Trypsin-EDTA bei der Zellablösung und warum ist es notwendig, diesen Schritt durchzuführen? Was sind die möglichen Gefahren oder Fehlerquellen während dieses Schrittes und wie können diese vermieden werden?

Lösung:

Schritt des Trypsinisierens im Subkultivierungsprotokoll:

• Beschreibung des Trypsinisierungsschritts: Der Prozess des Trypsinisierens ist ein wichtiger Schritt im Subkultivierungsprotokoll, bei dem die Zellen von der Oberfläche des Kulturgefäßes abgelöst werden. Dies geschieht mithilfe einer Trypsin-EDTA-Lösung. Trypsin ist ein Enzym, das Proteine zerschneidet, die die Zellen an die Oberfläche binden, während EDTA Kalziumionen chelatiert, die Zell-Zell-Verbindungen stabilisieren. Die Schritte sind wie folgt:
• 1. Entfernen des Kulturmediums und Waschen der Zellen mit PBS (Phosphatgepufferte Salzlösung), um restliches Medium zu entfernen.
• 2. Zugabe einer kleinen Menge Trypsin-EDTA-Lösung zum Kulturgefäß.
• 3. Inkubation bei 37°C für einige Minuten, bis die Zellen beginnen, sich von der Oberfläche zu lösen.
• 4. Überwachung der Ablösung unter dem Mikroskop. Sobald die Zellen abgelöst sind, wird Trypsin durch Zugabe von vollständig medifiziertem Medium inaktiviert.
• 5. Sammlung der Zellen durch Pipettieren und anschließend gegebenenfalls Zentrifugation, um die Zellen zu pelletieren.
• Rolle von Trypsin-EDTA: Die Rolle von Trypsin-EDTA besteht darin, die Zellen von der Kulturgefäßoberfläche zu lösen, indem es die Proteine verdaut, die die Zellen an die Oberfläche binden, und die Zell-Zell-Verbindungen destabilisiert.
• Notwendigkeit des Trypsin-Schrittes: Das Trypsinisieren ist notwendig, um die Zellen in Lösung zu bringen und sie zur weiteren Kultivierung oder Experimentation zu verwenden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Zellen weiterhin gesund und teilungsfähig bleiben.
• Mögliche Gefahren oder Fehlerquellen: Es gibt einige Gefahren und Fehlerquellen während des Trypsinisierungsprozesses:
• 1. Übertrypsinisierung: Zu langes Einwirken von Trypsin kann die Zellen schädigen oder sogar zum Zelltod führen. Um dies zu vermeiden, sollte die Trypsinisierung sorgfältig überwacht und sofort gestoppt werden, sobald sich die Zellen abgelöst haben.
• 2. Kontamination: Wie bei allen Zellkulturarbeiten besteht das Risiko einer Kontamination mit Mikroorganismen. Dies kann durch die Arbeit unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Werkbank minimiert werden.
• 3. Falsche Inaktivierung: Wenn Trypsin nicht vollständig inaktiviert wird, kann es weiterhin auf die Zellen einwirken und diese schädigen. Um dies zu vermeiden, sollte nach der Ablösung der Zellen möglichst rasch vollständiges Medium zugegeben werden.
• 4. Ungleichmäßige Zellablösung: Einige Zellen können härter an der Oberfläche haften als andere, was zu einer ungleichmäßigen Ablösung führen kann. Durch sanftes Pipettieren kann die Zellverteilung verbessert werden.
• Vermeidung der Fehlerquellen:
• 1. Überwache den Trypsinisierungsprozess genau unter dem Mikroskop.
• 2. Arbeite unter sterilen Bedingungen, um Kontaminationen zu vermeiden.
• 3. Neutralisiere Trypsin sofort nach der Zellablösung.
• 4. Verwende sanftes Pipettieren, um alle Zellen gleichmäßig abzulösen.

b)

Während der Zellzählung stellst Du fest, dass Du 1x10^6 Zellen in 10 ml Suspension hast. Du willst diese Zellen mit einem Passagierungsverhältnis von 1:6 auf neue Kulturgefäße verteilen. Berechne die Anzahl der Zellen, die in jedes neue Kulturgefäß pipettiert werden müssen. Beschreibe die nachfolgenden Schritte, um sicherzustellen, dass die Zellen homogen in die neuen Kulturgefäße verteilt werden.

Lösung:

Zellzählung und Verteilen der Zellen auf neue Kulturgefäße:

• Berechnung der Anzahl der Zellen pro Kulturgefäß:
• 1. Du hast insgesamt \(1 \times 10^6\) Zellen in 10 ml Suspension.
• 2. Ein Passagierungsverhältnis von 1:6 bedeutet, dass die Zellen auf 6 neue Kulturgefäße verteilt werden.
• 3. Berechne die Anzahl der Zellen, die in jedes Kulturgefäß pipettiert werden müssen:
• Gesamtanzahl der Zellen: \(1 \times 10^6\)
• Anzahl der neuen Kulturgefäße: 6
• Zellen pro Kulturgefäß: \( \frac{1 \times 10^6}{6} = 1.67 \times 10^5\) Zellen.
• Nachfolgende Schritte zur homogenen Verteilung der Zellen:
• 1. Resuspendieren: Nach der Zellzählung sicherstellen, dass die Zellen gleichmäßig in der Suspension verteilt sind, indem die Suspension durch vorsichtiges Pipettieren mehrmals auf und ab bewegt wird.
• 2. Aliquotieren der Zellen: Pipettiere die berechnete Anzahl von \(1.67 \times 10^5\) Zellen (entspricht einem Volumen von \( \frac{10 \text{ ml}}{6} \) = ca. 1.67 ml) in jedes der 6 neuen Kulturgefäße.
• 3. Zugabe von frischem Medium: Fülle jedes Kulturgefäß mit dem entsprechenden Volumen frischen Mediums auf, sodass jedes Gefäß die gleiche Endkonzentration von Zellen und Medium hat.
• 4. Inkubation: Stelle die neu passagierten Kulturgefäße in den Inkubator bei den für die Zelllinie geeigneten Bedingungen (z.B. 37°C, 5% CO₂).
• 5. Beobachtung: Überprüfe nach einigen Stunden oder am nächsten Tag die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie sich gleichmäßig verteilt haben und gesund aussehen.

Durch diese Schritte stellst Du sicher, dass die Zellen homogen verteilt werden und optimale Wachstumsbedingungen vorfinden.

Aufgabe 3)

Du arbeitest mit Fluoreszenzmikroskopie, um zelluläre Strukturen zu untersuchen. Dabei verwendest Du spezifische Fluoreszenzfarbstoffe zur Markierung von Zielmolekülen. Die Fluorophore absorbieren Licht einer bestimmten Wellenlänge und emittieren Licht einer längeren Wellenlänge. Du hast Zugriff auf verschiedene Mikroskopietechniken, einschließlich Weitfeld-, Konfokal- und Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie. Besondere Methoden wie FRET und FRAP stehen Dir zur Verfügung, ebenso wie hochauflösende Methoden, etwa STED, PALM und STORM. Bei der Probenvorbereitung musst Du Schritte wie Fixierung, Markierung und Einbettung beachten. Zu den wichtigen Parametern für die Fluoreszenzmikroskopie gehören Lichtquelle, Filter und Detektor.

a)

Erkläre den Unterschied zwischen Weitfeld-, Konfokal- und Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie. Welche Vorteile bieten die einzelnen Methoden und in welchen Szenarien würdest Du sie bevorzugt einsetzen?

Lösung:

Unterschied zwischen Weitfeld-, Konfokal- und Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie

• Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie:
  • Beschreibung: Bei der Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie wird die gesamte Probe gleichzeitig mit Licht einer bestimmten Wellenlänge beleuchtet, wodurch alle Fluorophore der Probe gleichzeitig angeregt werden.
  • Vorteile: Einfach zu bedienen, schnelle Bildaufnahme, geringe Kosten.
  • Bevorzugte Szenarien: Ideal für schnelle Untersuchungen von Proben mit gleichmäßiger Fluoreszenzverteilung oder für die Erfassung großer Probenbereiche.
• Konfokale Fluoreszenzmikroskopie:
  • Beschreibung: Bei der Konfokalmikroskopie werden punktweise einzelne Bereiche der Probe beleuchtet und das emittierte Licht wird ebenfalls punktweise detektiert. Dies reduziert Hintergrund- und Streulicht und ermöglicht eine höhere Auflösung.
  • Vorteile: Höhere Bildauflösung, verbesserter Kontrast, Fähigkeit zur optischen Schnittebene.
  • Bevorzugte Szenarien: Ideal zur Untersuchung von dicken Proben, dreidimensionalen Zellstrukturen oder für präzise zelluläre Lokalisationen.
• Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie:
  • Beschreibung: Bei der Multiphotonenmikroskopie wird die Probe durch die gleichzeitig Absorption von zwei oder mehr Photonen angeregt, die jeweils nur die halbe Energie (doppelte Wellenlänge) des benötigten Anregungslichtes haben. Dies ermöglicht eine gezielte Anregung nur in einer sehr kleinen Fokalebene tief in der Probe.
  • Vorteile: Geringer phototoxischer Effekt, tiefere Eindringtiefe in lebende Gewebe, reduzierte Photobleiche außerhalb der Fokalebene.
  • Bevorzugte Szenarien: Besonders geeignet für die Bildgebung in dicken, lebenden Geweben, wie beispielsweise in der intravitale Mikroskopie.

b)

Bei der Verwendung von Fluorophoren ist es wichtig, die Anregungs- und Emissionsspektren zu berücksichtigen. Erkläre, warum dies wichtig ist, und wie Du sicherstellst, dass die gewählten Filter und die Lichtquelle optimal auf die Fluorophore abgestimmt sind.

Lösung:

Wichtigkeit der Anregungs- und Emissionsspektren bei der Verwendung von Fluorophoren

Die Anregungs- und Emissionsspektren der Fluorophore sind entscheidend für eine effiziente Fluoreszenzmikroskopie. Hier sind die wichtigsten Punkte, die die Wichtigkeit und die optimalen Anpassungen betreffen:

• Anregungsspektrum: Das Anregungsspektrum eines Fluorophors beschreibt die Wellenlängen des Lichts, bei denen der Fluorophor effizient angeregt wird. Eine korrekte Abstimmung der Lichtquelle auf das Maximum des Anregungsspektrums ist wichtig, um die maximale Fluoreszenzintensität zu erreichen.
• Emissionsspektrum: Das Emissionsspektrum beschreibt die Wellenlängen des Lichts, die der Fluorophor nach der Anregung emittiert. Die Detektionsfilter müssen so gewählt werden, dass sie dieses Spektrum abdecken, um ein starkes und klares Signal zu gewährleisten.
• Wichtigkeit der richtigen Abstimmung:
  • Effizienz: Eine schlechte Abstimmung zwischen Lichtquelle und Anregungsspektrum oder zwischen Detektionsfilter und Emissionsspektrum führt zu einer ineffizienten Fluoreszenzanregung und schwacher Signalaufnahme.
  • Kontrast und Signal-Rausch-Verhältnis: Die richtige Abstimmung verbessert den Kontrast des Bildes, da unerwünschte Hintergrundsignale minimiert werden und das Signal-Rausch-Verhältnis steigt.
  • Vermeidung von Crosstalk: Bei der Verwendung mehrerer Fluorophore ist es wichtig, Filter und Lichtquellen so abzustimmen, dass Crosstalk (Überlappung der spektralen Signale) minimiert wird.

Sicherstellung der optimalen Abstimmung

• Experimentelle Planung: Wähle Fluorophore aus, deren Anregungs- und Emissionsspektren gut zu den verfügbaren Lichtquellen und Filtern passen. Prüfe vorab die Spektren der Fluorophore und die Spezifikationen der Mikroskopkomponenten.
• Lichtquellen: Verwende Lichtquellen, die die Anregungswellenlängen der ausgewählten Fluorophore abdecken. Das kann Laser, LEDs oder Xenon-/Quecksilberlampen umfassen.
• Filter: Setze Bandpassfilter ein, die genau die notwendigen Wellenlängenbereiche für Anregung und Emission abdecken. Dämpfe alle Wellenlängen außerhalb dieser Bereiche, um Hintergrundrauschen zu minimieren.
• Kalibrierung und Justierung: Überprüfe regelmäßig die Kalibrierung der optischen Komponenten und führe Justierungen durch, um optimalen Betrieb zu gewährleisten. Passen die Komponenten flexibel an verschiedene Fluorophore an.
• Konfigurationstools: Nutze Softwaretools, die Anregungs- und Emissionsspektren visualisieren und Dir helfen, optimale Filter- und Lichtquellenkombinationen zu bestimmen.

c)

Eine Deiner fluoreszierenden Proben zeigt während der Untersuchung einen Verlust an Fluoreszenzintensität über die Zeit hinweg. Beschreibe, welcher Mechanismus für diesen Verlust verantwortlich sein könnte, und schlage mindestens zwei Maßnahmen vor, um diesen Effekt zu minimieren.

Lösung:

Verlust der Fluoreszenzintensität: Mechanismus und Gegenmaßnahmen

Mechanismus: Photobleiche

Der Verlust an Fluoreszenzintensität während der Untersuchung wird hauptsächlich durch Photobleiche verursacht. Photobleiche ist ein Prozess, bei dem Fluorophore durch die Einwirkung von Licht irreversibel zerstört werden, wodurch ihre Fähigkeit zur Fluoreszenz verloren geht. Dieser Mechanismus tritt aufgrund der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies oder anderer reaktiver Moleküle auf, wenn die Fluorophore Licht absorbieren.

Maßnahmen zur Minimierung der Photobleiche

• Niedrigere Lichtintensität verwenden: Reduziere die Intensität der Lichtquelle, um die Belastung der Fluorophore zu verringern. Dies kann durch Anpassung der Beleuchtungsparameter oder durch Nutzung von Neutraldichtefiltern erfolgen. Dies minimiert die Menge an absorbiertem Licht und reduziert somit die Bildung von reaktiven Spezies.
• Antifade-Reagenzien hinzufügen: Verwende Antifade-Reagenzien (Antibleichmittel), die in die Probenlösung gegeben werden. Diese Reagenzien wirken als Radikalfänger und neutralisieren reaktive Sauerstoffspezies, bevor sie die Fluorophore beschädigen können. Beispiele für solche Reagenzien sind p-Phenyldiamin und Trolox.
• Kurze Belichtungszeiten: Begrenze die Belichtungszeit der Probe so weit wie möglich. Schnelle Aufnahmeverfahren und zeitlich modulierte Beleuchtung können dazu beitragen, die kumulative Lichtbelastung zu reduzieren.
• Abkühlung der Probe: Arbeite bei niedrigeren Temperaturen, um die photochemischen Reaktionen zu verlangsamen. Dies kann durch die Verwendung von Kühlkammern oder temperaturkontrollierten Mikroskopen erreicht werden.
• Speziellere Mikroskopietechniken: Nutze Techniken wie Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie, die eine geringere phototoxische Wirkung und weniger Photobleiche aufweisen, da nur in einer kleinen Fokalebene gleichzeitig Licht absorbiert wird.

Durch diese Schritte kannst Du die Photobleiche minimieren und die Lebensdauer der Fluorophore während der Untersuchung verlängern, wodurch eine gleichbleibende Fluoreszenzintensität ermöglicht wird.

d)

Du planst ein Experiment zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion in lebenden Zellen mittels FRET. Beschreibe den theoretischen Hintergrund von FRET und die wesentlichen Schritte, die Du bei der Durchführung dieses Experiments beachten musst. Berechne die FRET-Effizienz, wenn die Donor-Emission bei 520 nm gemessen wird und die Akzeptor-Emission bei 580 nm, wobei die Intensität der Donor-Emission in Abwesenheit des Akzeptors 1000 Einheiten beträgt und die Intensität in Anwesenheit des Akzeptors 600 Einheiten beträgt.

Lösung:

Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion mittels FRET: Theoretischer Hintergrund und Durchführung

Theoretischer Hintergrund von FRET

Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) ist eine Methode zur Untersuchung intermolekularer Wechselwirkungen in lebenden Zellen. FRET beruht auf der Energieübertragung von einem angeregten Fluorophor (Donor) auf einen zweiten Fluorophor (Akzeptor) ohne Emission eines Photons. Diese Übertragung tritt nur effizient auf, wenn Donor und Akzeptor sehr nahe beieinander sind (1-10 nm), was FRET ideal zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen macht.

Wesentliche Schritte zur Durchführung des Experiments

• Auswahl der Fluorophore: Wähle ein Fluorophor-Paar, bei dem das Emissionsspektrum des Donors das Anregungsspektrum des Akzeptors überlappt. Stelle sicher, dass sie kompatibel mit den Lichtquellen und Detektoren Deines Mikroskops sind.
• Konstruktion der Fusionsproteine: Erstelle Plasmide, die die Gene für das gewünschte Protein zusammen mit den Genen für die Donor- und Akzeptorfluorophore enthalten. Diese Fusionen können je nach Anforderung an das N- oder C-Terminus des Zielproteins angehängt werden.
• Transfektion der Zellen: Transfiziere die lebenden Zellen mit den Plasmiden, um die Expression der Fusionsproteine zu ermöglichen. Methoden wie Lipofektion, Elektroporation oder virale Transduktion können verwendet werden.
• Bilderfassung: Nutze die Fluoreszenzmikroskopie zur Anregung des Donors und erzeuge sowohl die Donor-Emission (bei 520 nm) als auch die Akzeptor-Emission (bei 580 nm). Messungen sollten in Anwesenheit und Abwesenheit des Akzeptors durchgeführt werden.
• Analysepunkte: Berechne die FRET-Effizienz anhand der Emissionsänderung des Donors in Anwesenheit des Akzeptors. Beurteile die Interaktion anhand der gemessenen Intensitätsänderungen.

Berechnung der FRET-Effizienz

Die FRET-Effizienz (E) kann anhand der Intensitätsänderung der Donor-Emission berechnet werden, wenn der Akzeptor anwesend ist:

\(E = \frac{{I_{D}^{\text{absent}} - I_{D}^{\text{present}}}}{{I_{D}^{\text{absent}}}}\)

Gegeben:

• \(I_{D}^{\text{absent}} = 1000\) Einheiten (Intensität der Donor-Emission ohne Akzeptor)
• \(I_{D}^{\text{present}} = 600\) Einheiten (Intensität der Donor-Emission mit Akzeptor)

FRET-Effizienz berechnen:

\(E = \frac{{1000 - 600}}{{1000}} = \frac{{400}}{{1000}} = 0.4\)

Die FRET-Effizienz beträgt demnach 40 %.

Durch sorgfältige Ausführung dieser Schritte kannst Du erfolgreich Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen mittels FRET untersuchen und quantifizieren.

Aufgabe 4)

Du führst ein Experiment durch, um die Migration von Fibroblasten in einer Zellkultur mithilfe von Live-Cell Imaging zu untersuchen. Die verwendete Technik ist die Fluoreszenzmikroskopie unter Einsatz von GFP (Green Fluorescent Protein) zur Markierung eines spezifischen Proteins, das an der Zellmigration beteiligt ist. Dabei analysierst Du die Bewegung der markierten Zellen über einen Zeitraum von 24 Stunden. Um die Datenmengen handhabbar zu machen, wirst Du periodische Bilder alle 15 Minuten aufnehmen.

a)

Beschreibe detailliert, welche Schritte Du durchführen musst, um die Zellen für die Live-Cell Imaging Analyse vorzubereiten. Beachte dabei alle relevanten Bestandteile inklusive Zellkultur, Transfektion und die Vorbereitung des Mikroskops.

Lösung:

• Zellkultur vorbereiten:Für das Experiment musst Du zunächst eine geeignete Zellkultur etablieren. Folgende Schritte sind notwendig:
  • Wähle eine geeignete Zelllinie, wie beispielsweise NIH 3T3 Fibroblasten.
  • Passe die Kulturbedingungen an, wie die geeignete Temperatur (37°C) und CO2-Konzentration (5%).
  • Passe das Nährmedium an, etwa DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) mit 10% FBS (fötales Rinderserum) und Antibiotika (z.B. Penicillin/Streptomycin).
• Transfektion der Zellen:Im nächsten Schritt erfolgt die Transfektion der Zellen mit dem Plasmid, das das GFP-markierte Protein kodiert
  • Bereite die Plasmidlösung vor: Isoliere das Plasmid, das das GFP kodiert, und stelle eine konzentrierte Lösung her.
  • Wähle eine geeignete Transfektionsmethode, wie Lipofektion oder Elektroporation, um das Plasmid in die Zellen einzuführen.
  • Führe die Transfektion durch, indem Du die Plasmidlösung in das Kulturmedium gibst und die empfohlenen Inkubationszeiten einhältst.
  • Überprüfe die Expression des GFP durch Fluoreszenzmikroskopie nach 24-48 Stunden.
• Vorbereitung des Mikroskops:Stelle das Fluoreszenzmikroskop für die Live-Cell Imaging Analyse ein
  • Wähle das richtige Mikroskop aus, das für Fluoreszenz geeignet ist.
  • Stelle die korrekten Filter für GFP ein (Anregungswellenlänge ~488 nm, Emissionswellenlänge ~509 nm).
  • Stelle den Fokus und die Belichtungszeit so ein, dass Du die markierten Zellen gut sichtbar machen kannst, ohne sie zu schädigen.
  • Richte die Zeiterfassung so ein, dass alle 15 Minuten eine Aufnahme gemacht wird.
• Platten mit Zellen vorbereiten:Sorge dafür, dass die Zellen richtig auf den Platten verteilt sind
  • Setze die transfizierten Zellen auf spezielle Zellkulturplatten oder Kammern, die für Live-Cell Imaging geeignet sind, wie z.B. MatTek Platten.
  • Achte darauf, die Zellkultur während der gesamten Dauer des Experiments zu sterilisieren und die Bedingungen aufrechtzuerhalten.
• Sicherstellen der Bedingungen während der Aufnahme:Achte auf die Erhaltung der Zellkulturbedingungen während der gesamten Aufnahmezeit
  • Stelle sicher, dass das Mikroskop mit einer gläsernen Inkubationskammer ausgestattet ist, um die Temperatur und CO2-Konzentration konstant zu halten.
  • Überprüfe regelmäßig den Zustand der Zellen und das Nährmedium während der gesamten 24 Stunden.
• Durchführung der Live-Cell Imaging Analyse:Halte die Bewegungen und Veränderungen der Zellen fest
  • Beginne die Bildaufnahme zu dem geplanten Zeitpunkt und reguliere die Bildaufnahme alle 15 Minuten über 24 Stunden.
  • Sichere die Bilder in einem geeigneten Format und zugeordneten Verzeichnissen für die spätere Bildanalyse.
  • Nimm ggf. Notizen zu den Beobachtungen und Zwischenergebnissen des Experiments.

b)

Phototoxizität und Photobleaching sind wesentliche Herausforderungen bei Live-Cell Imaging. Erkläre diese Phänomene und diskutiere drei Strategien, die Du anwenden kannst, um diese Probleme in Deinem Experiment zu minimieren.

Lösung:

• Phototoxizität und Photobleaching erklären:Phototoxizität tritt auf, wenn Zellen durch die Belichtung mit Licht während der Fluoreszenzmicroskopie beschädigt oder getötet werden. Das energiereiche Licht kann reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugen, welche schädlich für die zellulären Komponenten sind.Photobleaching bezeichnet den Verlust der Fluoreszenz einer Farbstoffmolekül (wie GFP) durch wiederholtes oder anhaltendes Belichten mit Licht. Das führt dazu, dass das Fluoreszenzsignal im Laufe der Zeit schwächer wird, was die Bildqualität und die Analyse beeinträchtigen kann.
• Strategien zur Minimierung von Phototoxizität und Photobleaching:
  • Verwende niedrigere Lichtintensität:Reduziere die Lichtintensität, um die Schädigung der Zellen und den Verlust von Fluoreszenz zu minimieren. Dies kann durch die Verkleinerung der Belichtungszeit oder durch Anpassung der Lichtquelle des Mikroskops erreicht werden.
  • Nutze optimierte Filtersets: Führe Filter ein, die nur die spezifischen Wellenlängen durchlassen, die für die Anregung und Emission von GFP notwendig sind. Dies reduziert die Exposition der Zellen gegenüber unnötigem Licht und minimiert so den Photobleaching-Effekt und die Phototoxizität.
  • Verwende Fluoreszenzschützer: Setze spezielle Medien oder Puffer ein, die antioxidative Substanzen enthalten, um reaktive Sauerstoffspezies zu neutralisieren und damit die Phototoxizität zu vermindern. Lösungsmittel wie ProLong Gold oder VECTASHIELD können auch helfen, Photobleaching zu reduziern.