DNA-Sequenzanalyse

DNA-Sequenzanalyse – einfach erklärt

Für die nähere Bestimmung der Verwandtschaftsverhältnisse von verschiedenen Arten kann die Methode der DNA-Sequenzanalyse genutzt werden. Sie kann bei z. B. zwei Arten mit ähnlichen Merkmalen Aufschluss darüber geben, ob sie tatsächlich nahe Verwandte sind oder sich im Laufe der Evolution, aufgrund von ähnlichen/gleichen Umweltbedingungen, lediglich in die gleiche Richtung entwickelt haben.

DNA-Sequenzierung – Ablauf

Für eine DNA-Sequenzierung muss zunächst die Sequenz bestimmter Gene der DNA bestimmt werden. Dieser Prozess heißt auch Sequenzierung. Dafür gibt es verschiedene Methoden, die im Laufe der Zeit immer präziser und schneller geworden sind.

Methoden zur DNA-Sequenzierung

Bei der DNA-Sequenzierung kann über verschiedene Methoden bestimmt werden, wie die Basenabfolge der DNA lautet. Die DNA ist aus der Aneinanderreihung der vier Basen Adenin, Thymin, Cytosin und Guanin aufgebaut. Ihre Reihenfolge muss bestimmt werden.

Sanger Sequenzierung

Die Sequenzierung nach Sanger ist die erste und grundlegende Methode zur DNA-Sequenzierung. Dafür werden folgende Zutaten gemischt und in ein Laborgerät gegeben, die automatisch ihre Temperatur ändern kann (je nachdem welcher Schritt der Sequenzierung gerade durchgeführt wird):

• DNA
• DNA Polymerase
• Primer
• dNTPs (die vier Basen der DNA)
• ddNTPs (speziell modifizierte Basen der DNA)

Zunächst wird die DNA bei hohen Temperaturen aufgetrennt, sodass nur noch Einzelstränge vorliegen, anstelle eines geschlossenen DNA-Doppelstrangs. Der Einzelstrang ist nun zugänglich für den Primer – ein DNA-Fragment, das nur wenige Basenpaare lang ist und sich an einen Bereich bindet, der komplementär ist.

An diesen Abschnitt kann jetzt die DNA Polymerase ansetzen. Sie erkennt, welche Base sich gerade unter ihr befindet, und setzt dementsprechend einen Strang zusammen, dessen Basen komplementär zum vorhandenen Strang sind. Auf diese Weise entsteht wieder ein Doppelstrang.

Jedoch sind in der Mischung auch modifizierte Basen vorhanden. Sie bewirken den Abbruch der Strangsynthese, da nach ihnen keine neue Base eingebaut werden kann. Außerdem sind sie markiert, heutzutage z. B. mit Leuchtstoffen in verschiedenen Farben. Die modifizierten Basen werden zufällig eingebaut, weshalb im Topf nach einer Weile viele DNA-Stränge mit verschiedenen Längen vorhanden sind. Durch Erhitzen werden die Doppelstränge wieder zu Einzelsträngen geteilt.

Mithilfe einer Gelelektrophorese können diese DNA-Fragmente ihrer Größe nach aufgetrennt werden. Die kürzeren Stränge fließen schneller und daher zuerst durchs Gel. Mithilfe eines Lasers kann detektiert werden, in welcher Reihenfolge die Leuchtstoffe an den ddNTPs durch das Gel laufen. Auf diese Weise kann die Reihenfolge der Basen in der DNA und somit ihre Sequenz bestimmt werden.

Next generation sequencing (NGS)

Das sogenannte Next Generation Sequencing beschreibt eine Gruppe neuartiger Methoden zur Sequenzierung der DNA, die sowohl günstiger als auch schneller und genauer sind als die traditionelle Sequenzierung nach Sanger.

Dabei können mehrere verschiedene Proben gleichzeitig sequenziert werden, da die DNA aus jeder Probe zunächst mit einer Art molekularem Barcode versehen wird, mit der sie später unterschieden werden können. Außerdem findet die Sequenzierung in Echtzeit statt, da bei den meisten Methoden schon der Einbau einer Base detektiert wird.

Vergleich der DNA-Sequenzen

Nach der Sequenzierung der DNA aus Blindschleichen (oder bestimmter Gene darauf), muss sie mit denselben Sequenzen anderer Arten verglichen werden. Je nachdem, welche Ähnlichkeiten sie aufweisen, können Rückschlüsse auf den Grad der Verwandtschaft geschlossen werden.

Diese Vergleiche werden mithilfe von bioinformatischen Methoden und großen Datenbanken durchgeführt. Die erhaltene Sequenz kann in der Datenbank mit bereits bekannten Sequenzen verglichen und eingeordnet werden.

Der BLAST-Algorithmus

Ein Algorithmus, der von vielen großen Datenbanken genutzt wird, ist der BLAST-Algorithmus (Basic Local Alignment Search Tool). Dieser spezielle Algorithmus nimmt sich zunächst stückweise kleine DNA-Sequenzen der eingegebenen DNA vor, die er mit bereits vorhandenen Sequenzen vergleicht. Sobald er Einträge gefunden hat, die Übereinstimmungen mit möglichst vielen dieser kurzen DNA-Sequenzen aufweisen, werden die kurzen Sequenzen ausgeweitet. Auf diese Weise werden Einträge schrittweise aussortiert, die doch keine so große Übereinstimmung mit der Sequenz mehr haben.

DNA-Sequenzierung – Auswertung

Um herauszufinden, wie die Verwandtschaftsverhältnisse zwischen verschiedenen Arten sind, muss bestimmt werden, wie unterschiedlich die Genome oder bestimmte Gene sind. Mehr Mutationen bedeuten auch eine weiter entferntere Verwandtschaft, da mehr Zeit vergangen ist, seitdem die beiden Arten einen gemeinsamen Vorfahren hatten. In dieser Zeit hatten Mutationen die Gelegenheit, sich ins Genom einzuschleichen und die Evolution voranzutreiben. Auch die Platzierung der Mutationen im Genom kann Auskunft darüber geben, welche Arten miteinander verwandt sind.

Eine Konvergenz, wie sie bereits erwähnt wurde, kann natürlich auch auf DNA Ebene vorkommen. Allerdings verändert sich die DNA im Laufe der Evolution hauptsächlich durch Mutationen. Genome verschiedener Lebewesen bestehen normalerweise aus mehreren Millionen bis Milliarden Basenpaaren, weshalb es hier sehr viel unwahrscheinlicher ist, dass sich die DNA zweier entfernter Spezies unabhängig voneinander gleich verändert.

Die DNA Sequenzanalyse ist daher nicht so fehleranfällig wie der Vergleich der Morphologie verschiedener Organismen, da Ähnlichkeiten in verschiedenen DNA-Sequenzen nicht so einfach missinterpretiert werden können.

DNA-Sequenzierung – Anwendungsgebiete

Um eine DNA-Sequenzanalyse durchzuführen, kann es viele Gründe geben. Dazu gehört nicht nur die Verwandtschaftsanalyse zweier Arten.

Probleme bei Sequenzierungen

Bei der Sequenzierung eines Genoms (für andere Zwecke als die Sequenzanalyse), ist es einfacher, die DNA zu unterteilen, bevor sie sequenziert wird. Dann muss nicht mit so langen Strängen gearbeitet werden und die Sequenzierung kann schneller durchgeführt werden.

Allerdings liegen dann am Ende die Basenabfolgen vieler kleiner Sequenzen vor. Diese müssen zu einer großen Sequenz zusammengesetzt werden, damit klar wird, an welcher Stelle des Genoms sich welches Gen befindet. Ohne Anhaltspunkte können die kurzen Sequenzen nicht so leicht zusammengepuzzelt werden. Mithilfe einer DNA-Sequenzanalyse können die kurzen Sequenzen daher mit bisher bekannten Genomen verglichen werden, damit ähnliche Sequenzen gefunden und die Reihenfolge rekonstruiert werden kann.

Ermittlung von Genfunktionen

Es ist noch nicht einmal annähernd für alle Stellen des menschlichen Genoms bekannt, welche Bereiche für welche Gene verantwortlich sind und was genau diese Gene bewirken. Die Maus hingegen ist ein Organismus, deren Genom viel gründlicher erforscht werden kann als das des Menschen, da Forschung und Experimente in einem ganz anderen Maß möglich sind als am Menschen.

Dazu zählt auch die Ermittlung von Funktionen bestimmter Gene. Ist daher der Nutzen eines Gens in der Maus bekannt, kann versucht werden, ein ähnliches Gen im Menschen zu finden.

Es kann sein, dass sich die Funktionen der Gene aus Mensch und Maus zumindest ähneln. Auf diese Weise könnte man in der Forschung schneller zu einem Ergebnis kommen.

Aufklärung von Krankheitsausbrüchen

In unserer heutigen Welt zieht sich der Verkehr um den gesamten Globus. Egal, ob Touristen oder Warenlieferungen, der Transport ans andere Ende der Welt geschieht innerhalb kürzester Zeit. Gleichzeitig gilt das aber leider auch für Krankheiten. Vor allem über Lebensmittel können Krankheitserreger wie Bakterien oder Viren schnell verbreitet werden. Um nachzuverfolgen, woher ein Krankheitserreger stammt und welchen Weg er seitdem genommen hat, können DNA-Sequenzierungen durchgeführt werden.

DNA-Vergleich Verwandtschaft

DNA-Sequenzierungen können genutzt werden, um Verwandtschaftsverhältnisse zwischen zwei Menschen zu ermitteln. Dabei werden mehrere Sequenzen auf ihre Ähnlichkeit hin untersucht, um eine Wahrscheinlichkeit zu erhalten, dass die zwei Menschen nah miteinander verwandt sind.

Vergleich von DNA-Sequenzierung und Aminosäuresequenzanalyse

Die DNA erfüllt ihre Funktion, indem sie im Laufe der Transkription zu RNA umgeschrieben wird. Diese wird wiederum bei der Translation als Bauanleitung für Proteine verwendet. Die RNA ist eine Kopie der DNA und wird lediglich als eine Art Mittelsmann verwendet, damit die DNA während der Translation geschützt im Zellkern bleiben kann.

Der Bau von Proteinen geschieht durch sogenannte Ribosomen, die immer drei Basen der RNA ablesen und diesen entsprechend dem genetischen Code eine Aminosäure zuordnen. Je nach Basenabfolge auf der RNA werden daher verschiedene Aminosäuren zu einer Polypeptidkette zusammengesetzt und bilden schließlich ein Protein.

Die Aminosäuresequenz beschreibt die Reihenfolge an Aminosäuren in der Polypeptidkette eines Proteins. Daher besteht ein Aminosäuresequenzvergleich aus dem Vergleich von Proteinen und den in ihnen verbauten Aminosäuren.

Aufgrund des beschriebenen Prozesses der Proteinbiosynthese kann allerdings auch geschlussfolgert werden, dass die DNA-Sequenz die Grundlage für eine Aminosäuresequenz ist. Zur Bestimmung der Aminosäuresequenz gibt es daher unter anderem die Möglichkeit, die DNA-Sequenz zu bestimmen. Die Aminosäuresequenz kann mithilfe des genetischen Codes einfach daraus geschlussfolgert werden.